Dacă nu ți-ai pus niciodată întrebările de mai sus sau pur și simplu nu ești genul de persoană care-și pune prea multe întrebări... atunci ai face bine să nu te chinui să citești ceea ce urmează (”for Dummies”, not ”for the really dumb that are not even trying”!).
Așa că să trecem la subiect...
Ceea ce spune legea LB este pur și simplu că există o relație între proprietățile unui material și absorbția luminii de către acel material.
În biochimie ”materialul” este de obicei soluția iar proprietatea care ne interesează este concentrația unei substanțe în soluție, pe care vrem să o aflăm pornind de la o presupunere destul de intuitivă: ”cantitatea” de lumină absorbită este cu atât mai mare cu cât concentrația substanței dizolvate, care absoarbe lumina este mai mare.
Forma dependeței dintre concentrație și absorbția luminii este următoarea:
#1cu notația:
(Se mai utilizează și mărimea numită transmisie:
...dar noi vom folosi noțiunea de extincție, fiind evidentă oricum relația dintre ele)
...acum să vedem ce înseamnă asta (în formula #1):
E : extincția (în engleză ”absorbance” și se notează cu A uneori)
I(0) și I, notat cu I(1) în fig. de mai sus : reprezintă intensitatea luminii înainte și după ce a trecut prin cuvă (eprubeta cu soluție)
c : concentrația (molară) a soluției
x : ditanța parcursă de lumină prin soluție
(Acum să facem o mică paranteză să vedem ce este I defapt.
Pentru cine nu vrea să se complice cu ce e mai jos:
În contextul care ne interesează pe noi, I este o măsură a energiei emise de sursa luminoasă (în unitate de timp).
Pentru cine vrea puțin mai mult:
...o să luăm definiția din fizică a intensității energetice a unei radiații:
...sau în cuvinte: I este cantitatea de energie (W) emisă în unitate de timp (t), într-un steradian (unghi solid Omega). Pentru problema de față o să ignorăm Omega, mai precis o sa-l considerăm constant deci neinteresant. Așa ca: Intensitatea energetică a luminii este proporțională (Omega e factorul de propoționalitate pt. ca îl considerăm constant) cu cantitatea de energie emisă de sursă în unitate de timp. Deci proba analizată spectrofotometric absoarbe o parte din această enegie, exprimată prin intensitate. Cei cu gândire mai... ”inginerească”, se gândesc probabil că senzorul care măsoară această intensitate are o sensibilitate care, desigur, variază intr-o oarecare măsură cu lungimea de undă. Acest efect ar ptea fi însă compensat la un anumit nivel (fie de procesorul electronic al aparatului de măsură, eventual de software sau chiar prin construcția senzorului...), cu toate că nu este necesar (și probabil nici nu se face acest lucru) întrucât măsurătorile se fac de obicei la aceeși lungime de undă (cea pentru care absorbția este maximă pentru substanța urmărită), deci orice variație a sensibilității senzorului ar ajunge să fie inclusă in constantele care sunt determinate experimental... Defapt oricum ideea e ca LB este o lege empirică, deci poate că nici nu are rost să exagerăm cu dezvoltarea modelului teoretic care oricum e departe de a fi ”corect”...)Cam asta a fost introducerea...
Dacă ne uităm din nou la expresia legii din #1. Pare destul de intuitivă până la logaritm. De ce folosim logI-logI(0) în loc de I-I(0)?
Am putea folosi a doua variantă dar... cand am reprezenta grafic de pendența E de c am avea o surpriză cam neplăcută: am vedea că nu avem de face cu o dependență liniară, deci formula este greșită. (În realitate oricum nu este perfect liniară... cum am spus mai sus, LB este empirică... dar este aproximativ liniară, unde ”aproximativ” = ”suficient de”, pentru cam orice aplicații practice din domeniul biochimiei).
(Paranteza, adică sări peste ea și mergi mai departe...
Pentru cei ”indrăgostiți” de puritate și exactitatea științifică (probabil la fel de inexistentă ca dumnezeul cu puteri absolute și viața după moarte :)) și care sunt probabil înspăimântați de cunvinte precum ”aproximativ”, ”suficient de” sau ”empiric”: Orice model teoretic este doar o aproximare a realității care este suficient de exactă doar într-un anumit context, la fel cum mecanica clasică este o aproximare a celei relativiste în contextul vitezelor mici, iar relativitatea generalizată probabil o altă aproximare a unui alt model teoretic care îl vom percepe ca realitate atunci când îl vom descoperi/inventa. Bineînțeles că până și noțiunile de ”aproximativ” și ”suficient” pot fi exprimate matematic, în termeni de erori și date statistice dar... deja se îngrașă paranteza :))
Așa că să ne întoarcem la ideea de mai sus și să încercăm să traducem limbajul matematic în cuvinte. Ce înseamnă dependență lineară? Înseamnă că intensitatea scade proporțional cu distanța parcursă, deci fiecare mm de soluție, de exemplu, absoarbe... să inventăm niște cantitați fictive ...1J de energie, deci dupa ce lumina cu intesitate inițială de, să zicem, 10 J strabate 3mm de soluție, intensitatea devine 10-1-1-1=7 J. (totul pe secundă)
Dacă ar fi adevărat raționamentul de mai sus, am avea I în loc de logI. Dar NU este așa!
Să încercăm să gândim altfel: daca fiecare mm de soluție nu absoarbe o anumită cantitate constantă de energie, ci un procent din energie care trece prin el. (analogie idioată: în primul caz, soluția cere o taxă de trecere fixă, luminii, în al doilea caz taxa de trecere e proporțională - ca orice impozit - cu lumina care trece). Prin urmare, daca procentul ar fi de 50%/mm, după 1mm parcurs prin soluție, I ar ajunge de la 10 la 5. După încă 1 mm de la 5 la 2,5... etc.
Acesta ar fi defapt raționamentul corect, pe care e bazată LB (valabila doar pt. concentrații mici și distanțe mici străbătute de lumină prin soluți; primul paragraf din sectiunea Derivation a articolului wikipedia http://en.wikipedia.org/wiki/Lambert-Beer dă și o explicație pt. asta).
Acum să încercăm să exprimăm raționamentul în limbaj matematic.
Pentru început, fracțiunea (dI/I) (”procentul” din paragraful anterior) din I absorbit de o porțiune de soluție extrem de mică (suficient de mică pentru a considera I constantă), este direct proporțional ( cu lungimea drumului parcurs de lumină prin această porțiune (dx):
Semnul ”-” apre doar pentru că dI e negativ (I scade).
Trebuie sa aflăm I în funcție de x (întreaga distanță străbatută de lumină prin amestec) și de I(0), deci integrăm cu I de la I(0) (inițial) la I (final) și dx de la 0 la x:
si în final:
#2
Trebuie sa aflăm I în funcție de x (întreaga distanță străbatută de lumină prin amestec) și de I(0), deci integrăm cu I de la I(0) (inițial) la I (final) și dx de la 0 la x:
si în final:
#2Expresia din stânga este bineînțeles E din #1 (doar ca e ln în loc de log, deci trebuie înmulțit cu 1 / ln 10). Întrucât depinde și de concentrația substanței care absoarbe lumină, iar această dependență nu poate fi decât inclusa în k din #2:
...pt. că, așa cum știți:
...și astfel am dedus LB până la forma #1, cu logaritm în bază 10.
Din #2 vedem și că:
...pt. că, așa cum știți:
...și astfel am dedus LB până la forma #1, cu logaritm în bază 10.
Din #2 vedem și că:
...corect fiind:
